Полимеразная цепная реакция — экспериментальный метод, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале (пробе).
Компоненты реакции
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — генетическая информации присущая всем живым организмам. Каждая нить состоит из соединенных последовательно нуклеотидов, закрученных в спираль. Важным свойством ДНК является ее способность удваиваться.
Описание процесса образования дочерней нити включает в себя следующие этапы:
- расплетение и расхождение нитей,
- присоединение олигонуклеотидов,
- достраивание цепи.
В результате, образуется ДНК, аналогичная материнской. Главную роль в образовании копий ее участков играют праймеры — короткие фрагменты нуклеиновой кислоты. Именно правильный их подбор, обеспечивает специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции. Он должен присутствовать только у исследуемого микроорганизма или гена. Синтез элементов с необходимой последовательностью нуклеотидов, осуществляется в автоматических синтезаторах.
Области применения
Полимеразная цепная реакция получила широкое применение не только в медицине, но и ветеринарии, микробиологии. А также:
- в судебно-медицинской практике (идентификация личности),
- для контроля состояния окружающей среды (поиск патогенных бактерий в почве, воде, воздухе),
- в археологии (идентификация вымерших видов растений, животных насекомых и т.д.)
- во многих других направлениях, где требуется определение наличия искомого объекта.
Забор анализа проводится в специализированных процедурных кабинетах.
Материалы для исследования
Название Количество Способ забора Цель диагностики Примечание Соскобы со слизистых из уретры у мужчин,
из уретры у женщин,
из цервикального канала,
со слизистых зева и дыхательных путей,
из конъюнктивы.
— У мужчин зонд вводят в уретру на глубину 4 см.
У женщин зонд вводят в уретру на глубину 1 см.
Для взятия образца из цервикального канала предварительно удаляют слизь с помощью стерильного ватного тампона, затем отбирают биоматериал на глубине 0,5-1 см.
В остальных случаях зондом проводят 1-2 раза по слизистым в месте локализации инфекционного процесса.
Обнаружение заболеваний, передающихся половым путем и поражающих слизистые оболочки. Отбор проб проводится вращательными движениями стерильным зондом. Нельзя допускать попадание крови в исследуемый материал. За 1,5-2 часа до исследования не ходить в туалет. Моча 50 мл В стерильный контейнер. Инфекционный процесс в мочеполовом тракте. Собирается первая порция утренней мочи. Мокрота 15-20 мл В стерильную одноразовую емкость. туберкулез,
респираторные формы хламидиоза и микоплазмоза.
— Кровь 1-1,5 мл венозной крови В стерильную пробирку с раствором цитрата натрия. вирус гепатитов B, C, D, G,
герпес,
цитомегаловирусная инфекция,
вирус иммунодефицита,
исследование генов.
Анализ сдается натощак. Биологические жидкости (плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная, секрет предстательной железы и слюна). 0,1-1,0 мл В стерильные розовые пробирки, с плотно закрывающимися крышками. По показаниям. — Биологические ткани желудка и 12-перстной кишки 2-3 мм В стерильные одноразовые пробирки, с плотно закрывающимися крышками. Хеликобактерная инфекция. Биопсия.
Подготовка к сдаче анализов
Чтобы правильно сдать анализ необходимо знать правила подготовки к нему:
- Мужчинам за 3 часа до сдачи спермы на анализ нельзя ходить в туалет, а также в течение 3 дней не следует посещать баню, есть острую пищу, пить спиртные напитки и вступать в половую связь.
- За 4 часа до взятия на анализ слюны нельзя кушать и принимать лекарства.
- Перед сдачей мочи необходимо провести туалет наружных половых органов.
- У женщин во время менструации анализ не берется.
- При сдаче урогенитального мазка необходимо соблюдать следующие рекомендации: за 2 недели до взятия пробы по возможности (посоветовавшись с врачом) отказаться от приема антибактериальных препаратов, за неделю не делать спринцеваний, не использовать вагинальные смазки и свечи, за 3 часа не посещать туалет.
Преимущества
Достоинством ПЦР является:
- Точно определяет наличие или отсутствие возбудителя.
- Выявляет генетический материал, характерный только для конкретного микроорганизма.
- Позволяет определить даже минимальное количество бактерий или вирусов.
- Для исследований могут быть использованы различные материалы.
- Выдача результатов в короткий срок — от нескольких часов.
- Обнаружение возбудителя на любой стадии заболевания.
- Получение высоких достоверных результатов.
Хранение биоматериала
Время от взятия крови до получения плазмы не должно быть более 6 часов.
Взятые образцы могут храниться при комнатной температуре не больше 2 часов, в холодильнике до суток при температуре 2-8°С. Более длительный период хранения возможен, но только в морозильной камере. Повторного замораживания после разморозки не допускается. Транспортируют биоматериал только в специальных контейнерах.
Назначение
Анализ проводят в ряде случаев:
- при подозрении на заболевание вирусной или бактериальной природы, грибковые патологии,
- для диагностики недугов передающихся половым путем (хламидиоз, трихоманиаз, уреаплазмоз, сифилис, гонорея и прочие),
- при ВИЧ, глистных инвазиях, лямблиозе,
- для онкодиагностики,
- для оценки эффективности проводимой терапии,
- при подозрении на неонатальные инфекции,
- для идентификация личности,
- для исследования донорской крови.
В современной медицине с помощью анализа ПЦР определяют отцовство.
Каждая нить ДНК имеет две альтернативные формы (аллели) одна из которых наследуется от биологической матери, другая от отца. Это означает, что по 50% генетического материала от каждого родителя. По совпадению локусов определяют генетическое родство. Точность полученных результатов очень высокая и повторная сдача не требуется. Чаще всего для анализа используется буккальный эпителий, но также можно использовать кровь, слюну волосы, ногти и другие биоматериалы, при этом точность анализа не зависит от выбора образца.
Для взятия эпителия подготовка не нужна, при сдаче крови нужно воздержаться от приема алкоголя, жирной пищи, сдавать натощак. Эпителий из полости рта берется стерильной ватной палочкой в течение 10 секунд, затем кладется в конверт и отправляется на исследование. В лаборатории из взятого материала выделяют ДНК, затем с помощью необходимых реагентов копируют. Полученные материалы отца и предполагаемого ребенка сравниваются, путем изучения участков хромосом, занятых одним геном. Совпадение локусов говорит об отцовстве, а их отсутствие об исключении биологического родства. При этом родство отца и ребенка никогда не устанавливается на 100%.
Ограничения способа
Существуют и недостатки такого метода исследования:
- Происходит увеличение участков дезоксирибонуклеиновой кислоты как в живом, так в погибшем микроорганизме, так что требуется контрольное проведение анализа после полной элиминации возбудителя.
- Возможность ложноположительного результата из-за наличия живых организмов другого вида, но с таким же генетическим фрагментом.
- Возможная изменчивость генотипа исследуемого возбудителя, вследствие чего он не определяется в ходе реакции.
Расшифровка результатов
Результаты реакции в качественном отношении могут быть двух видов: при обнаружении искомого возбудителя в бланке будет указано — обнаружено, при его отсутствии — не обнаружено.
Оценка результата анализа позволяет определить:
- количество возбудителя находящегося в исследуемом материале,
- эффективность терапии,
- развитие устойчивости к препаратам,
- интенсивность развития заболевания.